ELISpot底板材質的改進
自1983年ELISPOT技術創立之初,檢測底板使用的是普通塑料板,但由于塑料板的蛋白吸附能力差,實驗的靈敏度有限,因此也限制了ELISpot技術的發展。1985年,Moller SA和Borrebaeck CA將硝酸纖維素膜作為底板,引入ELISPOT中用于檢測分泌抗體的陽性B細胞,獲得了遠優于塑料板的結果。
不過硝酸纖維素(包括醋酸纖維素)也有自身的不足。由于它是天然纖維素經過人工酯化后獲得的,纖維排列不規則,膜表面平整度差,導致表面形成的斑點外形破碎,高低錯落,并且邊緣彌散。另外,纖維素還存在機械承受力差,化學穩定性差,不利于長時間保存等缺點。
1995年,荷蘭Utrecht大學免疫研究所的Schielen P團隊把一種更優于硝酸纖維素膜的PVDF膜引入了ELISPOT檢測中。PVDF是完全人工合成的,可以控制其纖維的長度與排列方式,從而獲得幾乎完美的膜結構。相比硝酸纖維素膜,PVDF膜具有更優的蛋白吸附性質,更加均勻的膜結構以及更加精細的顯色條帶分辨率。因此,PVDF的引入是繼硝酸纖維素膜之后,ELISPOT底板材料的又一次重大突破。至今,除了BD公司還在沿用硝酸纖維素膜板外,其余全球所有的ELISpot試劑公司都用PVDF膜取代了硝酸纖維素膜。
PVDF膜的乙醇活化
由于PVDF膜是疏水性的,因此在使用前須用乙醇潤濕后才能使用。酒精活化的PVDF膜板可以顯著強化斑點的清晰度和可讀性,增加斑點數量,提高ELISPot檢測的靈敏度。
乙醇活化PVDF膜的快速指南
■乙醇活化—乙醇的濃度和加入的時間是關鍵
☆MSIP和IPFL板:每孔加入15 μl 35%的乙醇溶液,潤濕時間不超過1 min;
☆MAIPSWU板:每孔加入50 μl 70%的乙醇溶液,潤濕時間不超過2 min;
■板子的清洗:每孔加入200 μl的無菌水進行清洗,重復5次。
■加入包被抗體:每孔加入100 μl PBS稀釋好的包被抗體,4℃包被過夜。
乙醇活化PVDF膜的注意事項:
■未潤濕的PVDF膜是潔白,不透明的;經乙醇潤濕后,顏色變暗,呈半透明狀,很容易觀察二者的區別。
■加乙醇時,槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方,注意槍頭不要刺到PVDF膜。
■ 若加入的乙醇掛在孔壁上,蓋上板蓋,輕輕叩擊,讓乙醇順勢滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜,就會在表面張力和毛細作用下迅速浸潤整塊膜,使得膜的顏色和透明度發生變化。
■乙醇加入的體積是經過優化的,請勿隨意加大或減少用量。
■膜在潤濕后避免過長時間的孵育,因為酒精的揮發會導致膜的高疏水性。
■預濕后的乙醇必須被有效的清洗掉,因為殘留的乙醇會干擾斑點的形成。
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