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拿什么拯救您的細胞穩轉實驗?是時候展現真正的技術了

作者:admin信息來源:達科為日期:2019年02月28日打印字體:  
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一般來說,外源基因導入動物細胞可分為瞬時轉染和穩定轉染。瞬時轉染導入的DNA僅能在動物細胞中維持數天,穩定轉染導入的DNA能整合進動物細胞基因組中,隨后細胞經過分裂增殖形成穩定表達轉染基因的細胞系。在轉染的基因表達質粒(或共轉質粒)上添加選擇標記,是篩選穩定轉染細胞的最常用方法之一。

想要做好穩轉,掌握下列幾項妥妥的沒問題~

一、選擇穩轉質粒

需要含有選擇標記(例如抗生素抗性基因)的基因表達質粒,選擇標記可以位于基因表達質粒上,或者位于共轉染的單獨的質粒上。陰性對照應使用不含選擇標記的基因表達質粒轉染細胞。 

二、穩轉之前 

  • 確保使用的細胞系可以從分離的細胞中產生克隆,因為一些細胞需要互相接觸才能生長;

  • 選擇合適的篩選標記;

  • 選擇適合您細胞類型的轉染方法;

  • 通過建立劑量-反應曲線(殺傷曲線)確定細胞類型的篩選條件(Ausubel等,1995)。

三、殺傷曲線建立

最適濃度通過建立細胞殺傷曲線來確定。每種真核細胞系對不同抗生素的敏感度不同(某些細胞系能夠完全抵抗某種抗當素),針對每種用于穩定轉染的新細胞系或細胞株,殺死未轉染細胞所需的最適濃度必須通過實驗來確定。

(*應為每種細胞類型建立殺傷曲線,并且每次使用新批次的選擇性抗生素)


遺傳霉素(Geneticin, G418)是一種氨基糖甙抗生素,是穩定轉染常用的篩選抗生素之一。哺乳動物細胞的篩選濃度根據細胞類型等多種因素而變化,以InvivoGen的G418為例(不同廠家不同批次產品溶解度各有差異,僅供參考)。在開始實驗前,建議通過測試幾種濃度(100 μg/ ml至1 mg / ml)來確定殺死宿主細胞系所需的最佳抗生素濃度。

InvivoGen建議的工作濃度:G418通常以400 μg/ ml的濃度使用。當然仍需要為您的細胞確定最佳濃度。下面列出了常見哺乳動物細胞使用G418篩選的濃度(參見下表)。

好不容易get到了實驗技巧,奈何無機會試手?

小達君在開學/開工之際為大家準備了InvivoGen的篩選抗生素G418免費試用裝

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純度:≥90%(HPLC)

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細胞測試:在G418敏感和G418抗性哺乳動物細胞系中驗證產品效果

產品信息

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規格

貨號

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1 g (10 x 1ml)

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¥1,204

InvivoGen

5 g (1 x 50 ml)

ant-gn-5

¥3,169


InvivoGen 1977年成立于法國,是法國最早的生物科技公司。公司成立的初期階段主要提供細胞培養相關試劑,如抗支原體、細菌、真菌污染的抗生素以及基因篩選抗生素(Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin)。隨著天然免疫研究熱點的興起,InvivoGen于2000年開始致力于天然免疫相關產品的研發和生產,并成為全世界最優質、最專業的天然免疫相關產品生產商。InvivoGen為天然免疫研究提供一整套研究方案,包括不斷更新的模式識別受體(PRRs)激動劑和拮抗劑,PRRs報告基因細胞以及天然免疫信號通路的誘導劑和抑制劑等。


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