1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2. 將所需的培養基確保瓶身干凈后放于工作臺面內，點燃酒精燈，將培養基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。

3. 取1個高壓后的新培養瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側，把保種管在超凈臺外用酒精棉球擦拭下2/3后拿進超凈臺內在酒精燈上消毒保種管口2-3次放于臺面左手邊，取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取保種管內的細胞液，懸空移入培養瓶內。

4. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基瓶內吸取4ml培養基再懸空移入培養瓶內，將培養瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實驗標記。

5. 將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

6. 將培養瓶放于28℃,5%CO2的培養箱內培養，旋開瓶口少許。注意整個培養箱底托盤內一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

 在CO2培養箱內培養10-12h，瓶蓋擰緊后拿出培養箱，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，及細胞形態。最后更換培養液。