1. ELISPOT技術的創立

  l 先驅：Don Mason

ELISPOT技術的原型起初可以追朔到1978年的牛津大學，工作于此的Don Mason教授在隨后的兩年研究期間，開創了一種“膠片上的斑點技術”。

他的做法如下：首先在蓋玻片上包被抗原，然后把玻片放到細胞培養皿的皿底；接著在培養皿內加入B細胞，有些B細胞已經分化為漿細胞，能夠大量分泌特異性的抗體，分泌出來的抗體就會和蓋玻片上的抗原結合；大約3-5個小時之后，洗去玻片上的B細胞和各種雜質，然后把玻片浸入被放射性碘同位素標記的二抗溶液中孵育一小時；洗滌之后，在玻片上覆蓋膠片放色自顯影，一個個斑點就在膠片上顯示出來了。每一個斑點就代表了一個分泌特異性抗體的漿細胞。

如果把ELISPOT技術的核心定義為：“將細胞的分泌行為通過斑點顯示出來”，那么Don Mason教授這種“膠片上的斑點”已經具備了ELISPOT技術的基本特征，并且也滿足“一個陽性細胞，對應一個ELISPOT斑點”這條原則。所以把英國牛津大學的Don Mason教授稱為ELISPOT技術先驅絲毫不為過。

l 創立：Sedgwich與Czerkinsky

ELISPOT技術的真正創立要等到5年之后的1983年。這一年，在南北兩個半球地理位置相距遙遠的兩個研究小組幾乎同時、獨立地創立了這項技術。一個研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人是當時正在當地Margaret女王醫院兒童醫學研究所攻讀博士學位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一個研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學醫學微生物系的學者Cecil C. Czerkinsky（Czerkinsky CC et. al., 1983a）。

受當時新興技術ELISA的啟迪，Sedgwich與Czerkinsky都選取了塑料微孔板作為固相材料。這種塑料的微孔板既可以作為抗原包被的載體，也可以作為細胞孵育的場所。他們將抗原包被到微孔板的板底，然后加入B細胞孵育。在此過程中，一部分B細胞分泌的特異性的抗體與板底的抗原結合。在實驗初期，他們都選擇了酶標記的二抗，而非放射性同位素標記的二抗。推測也是受到了ELISA技術的啟迪。

但是問題也隨酶標二抗而至，當時的顯色底物都是可溶的。這對于ELISA根本不是問題，因為ELISA就是要檢測可溶底物的光密度。但如果ELISPOT顯色底物也可以溶解的話，那么產生的斑點將隨著溶液微小的擾動而消失。對此，他們不約而同地想到了把顯色底物做成瓊脂糖的凝膠，通過凝膠固定可溶的色素分子，從而產生斑點。

前者開創ELISPOT方法是為了研究B淋巴細胞分泌IgM抗體的情況（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴細胞分泌抗體的情況（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），還應用于大腸桿菌分泌腸毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纖維細胞分泌纖維連接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究。雖然研究的對象不一樣，但該實驗技術所涉及的原理以及方法步驟和我們現在標準ELISPOT幾乎完全相同。

Sedgwick論文發表的時間略早一些，Czerkinsky則發明了“ELISPOT”這個名詞，由于他們的研究都是各自獨立開展，所以被公認為ELISPOT技術的創立人。

這二十多年來，ELISPOT基本原理并沒有什么重大變化，但技術卻一直在進步，諸如：檢測材料的改進，實驗靈敏度與重復性的提高，實驗應用領域的拓寬等。

2. ELISPOT技術的發展

l 底板材質的改進

ELISPOT技術先驅者DonMason用的固體基質是玻璃片，由于玻璃片使用不便等諸多因素的影響，致使該技術在當時并沒有得到很好的推廣。Sedgwich與Czerkinsky創立ELISPOT技術之后，檢測底板都是使用普通的塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此實驗靈敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 將膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），檢測的也是分泌抗體的陽性B細胞。他們引入的是硝酸纖維素膜（NC膜），獲得了遠優于塑料板的結果。

不過硝酸纖維素（包括醋酸纖維素）也有自身的不足。由于它是天然纖維素經過人工酯化后獲得的，纖維排列不規則，膜表面的平整度差，導致表面形成的斑點外形破碎，高低錯落，并且邊緣彌散。這就好比在粗糙的麻布上寫小字，字跡就會模糊不清。另外纖維素還存在機械承受力差，化學穩定性差，不利于長時間保存等缺點。但有一點，硝酸纖維素膜不需預先用酒精潤濕，所以現在BD公司還在沿用維素膜板。

1995年，荷蘭Utrecht大學免疫研究所的Schielen P團隊 把一種更優于硝酸纖維素膜的PVDF膜也引入了ELISPOT檢測中（Schielen P et. al., 1995）。PVDF（聚偏二氟乙烯）是完全人工合成的，可以控制其纖維的長度與排列方式，從而獲得幾乎完美的膜結構。做過Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纖維素膜有更優異的蛋白吸附性質，更加均勻的膜結構，更加精細的顯色條帶分辨率，更強的機械承受力與耐化學腐蝕性能。PVDF膜上的斑點質量是纖維素膜上的斑點所無法相比的。本手冊中所有的紅色斑點都是使用Millipore公司PVDF板做出來的。有一點要提醒，PVDF膜本身是疏水的，需要預先用乙醇潤濕。PVDF膜的引入是繼硝酸纖維素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。至今，除了BD公司還在堅持使用纖維素膜板之外，其余所有的ELISPOT試劑公司都用PVDF膜取代了纖維素膜（Weiss AJ 2005）。

塑料板被膜板取代之后，沉寂了許多年。近幾年又開始興旺起來（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。著名的ELISPOT塑料板當數荷蘭U-Cytech公司研發的透明板，已經成為了該公司的一大特色。ELISPOT塑料板的重新興旺有兩個方面的原因：一方面是技術進步，塑料材質改進后，板底吸附蛋白的能力已經比傳統的塑料板有了很大提高，雖然還趕不上膜板，但已經完全達到ELISPOT實驗對膜板材質的要求。更高質量的抗體也有利于塑料板獲得更好的ELISPOT結果。另一方面歸因于塑料板自身的優勢，相對低廉的價格，簡化的操作步驟，較短的實驗時間都是塑料板的優勢（Ronnelid J et. al., 1997）。此外對于透明板，還可以在實驗中隨時觀察細胞的狀態與密度，這對新手是很重要的。

l 檢測內容的多樣化

ELISPOT技術創立之初，只是用于檢測B淋巴細胞分泌的抗體，包括各種類型免疫球蛋白，包被材料是特異性抗原或者抗體的抗體（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。B細胞（尤其是分化成熟之后的漿細胞）分泌抗體的量一般比較大，容易檢測，即使早期ELISPOT檢測的靈敏度不夠高，檢測大量分泌的抗體還是不成問題的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。時至今日，ELISPOT檢測還廣泛地用來研究粘膜免疫中的抗體分泌情況（Holmgren J et. al., 2005）。

后來隨著技術進步，ELISPOT檢測靈敏度有了大幅度的提高，以至于可檢測到痕量的細胞因子，因此它的主要應用就轉移到檢測細胞因子上（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）?，F在各種常見細胞因子的檢測都有了商業化的試劑盒，使用起來非常方面。能商業化檢測的細胞因子包括人類、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干擾素（IFN-γ）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、顆粒酶（Granzyme B）、腫瘤壞死因子（TNF-α）。目前全球ELISPOT試劑盒的主要供應商有：荷蘭U-CyTech公司、瑞典Mabtech公司、法國Diaclone公司、美國BD Pharmingen公司和R&D公司。他們的產品各有特點，其中荷蘭U-CyTech公司的產品質優價廉，在國內市場居于主導地位。

l 預包被化

在時間寶貴，追求效率的今日，預包被化是ELISPOT技術發展的必然。作為參照，我們知道ELISA技術剛剛出現的時候，ELISA試劑盒都是未包被的，需要使用者自己臨時包被。但是時至今日，幾乎所有的ELISA產品都實現了預包被化。預包被是ELISPOT技術成熟的標志和在更大范圍內應用的前提。

如圖2.1所示，預包被有著明顯的技術優勢。PVDF板的ELISPOT試驗一共需要3天時間，采用預包被板可以節省一天的時間，當天處理細胞，當天上板檢測；未包被的檢測共有13步，預包被可以省掉其中的5步，并且這5部都是需要無菌操作的步驟，占整個無菌操作步驟的5/6。節省時間只是其一，由于減少了無菌操作的步驟，使得整個實驗污染與出錯的概率大大降低，提高了整體試驗的成功率。

綜上，ELISPOT預包被技術在產品中的運用可以幫助廣大實驗者解決諸多問題。從目前的市場反饋情況來看，該技術在推廣過程中還需要一段磨礪。導致其推廣受限制的原因一方面來自成熟產品的產品價格，另外一方面源自實驗者的人力成本因素，在此就不詳加講述。

憑借扎實、足夠的技術儲備，加上和荷蘭U-CyTech公司深度合作，達科為公司先后推出了Quick Spot?系列預包被ELISPOT試劑盒，并于09年底在國內率先從Millipore公司引入可拆卸PVDF膜板推出預包被可拆卸試劑盒。達科為公司預包被試劑盒產品在2013.6月將實現全面升級，升級后產品價格較之現有價格沒有變動，試劑盒配備試劑除了原有的【預包被板、檢測抗體、HRP酶、顯色底物、洗滌濃縮液、稀釋緩沖液】，更增添了陽性刺激物！