l 背景知識

我們都知道，內毒素的化學本質是革蘭氏陰性細菌的脂多糖。它可以激活免疫細胞的受體TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2，從而引發免疫細胞內一系列的反應，包括產生一系列細胞因子，從而啟動先天免疫應答（Poltorak, A. et. al., 1998）。

實際上，內毒素只是一大類能通過TLR受體家族激活先天免疫系統的供體中的一種。其它的供體還包括細菌共有的Lipopetide、脂蛋白（Lipoprotein）、鞭毛蛋白（Flagellin）（vison, S. M et. al., 2007）；革蘭氏陰性菌的多聚甘露糖醛酸（Mannuronic acid polymer）、非典型脂多糖（Atypical lipopolysaccharide）、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白（Porin）、外膜蛋白A（Outer membrane protein A）、菌體糖脂質（Glycolipid）、菌毛蛋白A（CsgA）；革蘭氏陽性菌的肽聚糖、磷壁酸；分枝桿菌中特有的三乙酰化脂蛋白（Triacetylated lipoprotein）、二乙酰化脂肽（Diacetylated lipopeptide）、脂阿拉伯甘露糖（Lipoarabinomannan）、結核分支桿菌的結核素（STF）；支原體的二乙酰化脂肽；錐蟲的糖肌醇磷脂（Glycoinositolphospholipids），弓形蟲的Profilin-like protein；真菌的酵母聚糖；病毒的未甲基化CpG DNA、 ssRNA、 dsRNA，某些病毒的膜蛋白與膜融合蛋白。

這些外源病原性的供體刺激TLR受體家族之后，共有4條信號通路，包括：1依賴于MyD88（骨髓分化基因）信號通路，這是主要通路；2不依賴于MyD88信號通路；3Small GTPase信號通路；4PIP信號通路。四條通路也相互偶聯成網，激活后面的效應途徑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和NF-κB途徑等等（Oda, K et. al., 2006）。

一旦這些非特異性細胞免疫途徑激活，作為檢測特異性細胞免疫的ELISPOT檢測必然會受到干擾。屆時，我們將無法區別哪些斑點是特異性抗原刺激產生的，哪些是非特異性的細胞免疫反應產生的。所以，增加ELISPOT檢測可信度，提高檢測重復性的一個重要環節就是要嚴格控制好以內毒素為首的可能干擾ELISPOT檢測的各種TLR供體。

l 應對措施

實際實驗中，最容易出現的TLR供體干擾來源是微生物的污染，包括細菌、真菌和酵母。為了盡可能避免內毒素對實驗結果產生的干擾，重點要做好以下幾個方面：

 1選擇高品質的ELISPOT試劑盒，試劑盒內的成分應該盡量完整。我們推薦達科為/U-Cytech公司的產品。該產品的質量已為國內客戶多年的使用所證實，并且試劑盒內的各種成分非常齊備，除客戶必須自備的Milli Q和PBS之外，客戶不需要自行準備其它試劑，避免了引入各種TLR供體而干擾實驗。

作為對比，BD公司和Diaclone公司的ELISPOT試劑需要客戶自行準備封閉液以及抗體稀釋液，Mabtech公司更是只提供抗體對。特別指出：自行準備的封閉液，封閉之后會直接接觸檢測細胞，引入受污染的微生物或者內毒素是很普遍的。這就會導致背景變臟，負對照產生額外的斑點，并且實驗孔中特異性的斑點與非特異性的斑點混雜，最終影響整個實驗的重復性與可信度。

ELISPOT檢測中，無菌操作部分需要的各種溶液應該在潔凈的空間內（比如超凈臺內）配制，盡量采用過濾除菌的方式。以未包被ELISPOT試劑為例，需要保持嚴格潔凈的溶液有：潤濕PVDF膜的酒精、洗滌用超純水或者PBS、包被抗體以及抗體稀釋液、封閉液、培養基、刺激物。

在潔凈的空間內配制可以有效避免灰塵以及其它污染物。采用過濾除菌可以有效濾除菌體，如果用高壓滅菌，容易引起生物活性成分失活，而且死亡的菌體反而會釋放出更多的TLR供體成分。

使用無內毒素的各種耗材、器皿。有些實驗室習慣于使用一次性塑料耗材培養細胞或者做實驗，這些耗材確實使用方便，并且能避免污染。但對于ELISPOT檢測而言，最好選用已經表明不含熱源的品牌。如果使用可重復使用的玻璃器皿，注意嚴格浸泡洗液，嚴格清洗。內毒素或者某些TLR供體的化學性質非常穩定，只有在濃硫酸/重鉻酸鉀的洗液中或者170°C烘烤4小時才會完全分解。

使用高質量的刺激物。

使用達優?無血清培養基。

嚴格的無菌操作。

總之，內毒素以及其它TLR供體是ELISPOT檢測中一大類干擾源。它們并不會導致ELISPOT檢測的完全失敗，故初學者這些干擾源不會太在意。但是要獲得高質量的檢測結果，增加實驗的可信度與重復性，一個進階的實驗者必須考慮這些問題了。