• 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)

• 延長(zhǎng)樣本的保存，獲得充足的上機(jī)時(shí)間。

• 生物安全性考慮

• 對(duì)蛋白翻譯后修飾的檢測(cè)

在蛋白翻譯后修飾（磷酸化、乙酰化、甲基化等）的研究過(guò)程中，固定劑不僅可以有效的“固定”住翻譯后修飾的位點(diǎn)（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等），也可以防止目標(biāo)位點(diǎn)在活細(xì)胞中很快降解（比如磷酸酶會(huì)去除磷酸化修飾、去甲基化酶會(huì)移除甲基化修飾等）。下面的例子是用IL-6的重組蛋白刺激人外周血15分鐘后看STAT3第705位酪氨酸的磷酸化水平，在刺激完樣本后就需要通過(guò)固定來(lái)實(shí)現(xiàn)目的氨基酸磷酸化水平“停留”在IL-6刺激15分鐘這個(gè)節(jié)點(diǎn)上。

• 脫水劑類（如乙醇、甲醇）

• 交聯(lián)劑類（如甲醛、戊二醛）

理想的固定劑能使抗原固定，同時(shí)保持細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真實(shí)性，同時(shí)能夠保證抗體與所有細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)抗原的充分接觸。但“理想很豐滿，現(xiàn)實(shí)很骨干”，固定的過(guò)程或多或少對(duì)流式檢測(cè)帶來(lái)一些影響，只有了解了固定對(duì)流式染色帶來(lái)的影響我們才能更好的做好流式實(shí)驗(yàn)。

• 固定對(duì)熒光染料的影響是什么？

主要表現(xiàn)在固定劑對(duì)串聯(lián)染料（tandem-dye，如APC/Cy7、PE/Cy7等）的影響：一個(gè)是固定劑有可能造成串聯(lián)染料的斷裂，比如APC-Cy7和4%多聚甲醛溶液接觸時(shí)間超過(guò)4個(gè)小時(shí)染料就有可能斷裂，所以如果細(xì)胞直接重懸在固定液里面建議盡快上機(jī)，如果要放到第二天上機(jī)，需離心去除固定液后重懸在流式染色液或者是PBS里面，當(dāng)然有一些新的串聯(lián)熒光素可以有效減少這種情況，比如BioLegend的APC/Fire750^TM染料。

另外一個(gè)是固定劑有可能造成串聯(lián)染料的熒光“溢漏（spillover）”增加，對(duì)于這類情況的建議是配色允許的情況下減少串聯(lián)染料的使用（但實(shí)際上很多多色panel來(lái)說(shuō)，這都不算是一個(gè)解決方案）；另外，使用一些商業(yè)化的固定buffer，也有可以在一定程度上減少熒光“溢漏”，如下圖所示：

• 4%多聚甲醛溶液固定后的樣本可以保存多久？

一般建議不要超過(guò)24個(gè)小時(shí)，固定后的樣本放置時(shí)間越久，背景信號(hào)會(huì)越高，即使固定后的細(xì)胞重懸在不含固定劑成分的緩沖液中也會(huì)造成背景升高（我們建議固定后的樣本離心除去固定劑，重懸在流式染色緩沖液或者PBS里面）。

如果需要長(zhǎng)時(shí)間保存樣本，建議在樣本做完表面染色和固定后，保存在專門的保存緩沖液中。但即便是有專門的保存buffer，對(duì)于用了串聯(lián)染料（如APC/Cy7、PE/Cy7等）染色的樣本，我們還是建議不要長(zhǎng)時(shí)間保存，很難避免補(bǔ)償?shù)摹捌疲?/span>shift）”。

左圖：human PBMC刺激完當(dāng)天染色后上機(jī)檢測(cè)；右圖：同一樣本，表染和固定后，保存在Cyto-Last? buffer里面，14天后做胞內(nèi)染色并上機(jī)。

• Ki-67染色時(shí)，選擇哪種固定方式？

流式在檢測(cè)一些特殊的核內(nèi)指標(biāo)時(shí)，一般都會(huì)有推薦的固定破膜方案。比如在Ki-67染色一般會(huì)推薦用70%的冰乙醇作為固定劑（含打孔作用），如前文提到的脫水劑類固定劑對(duì)蛋白空構(gòu)象的影響大，在單染Ki-67的時(shí)候，乙醇的固定方式是完全沒(méi)有問(wèn)題的，但是在和其它指標(biāo)共染時(shí)，就需要考慮乙醇固定的方式和其它抗體兼容性的問(wèn)題，比如CD38 (Clone: HIT2)的抗體是明確不能和乙醇固定的方式兼容，而CD34 (Clone: 581)很大程度上可以兼容這種固定方式。醇類和其它抗體（Clone）的兼容性很難一一驗(yàn)證，所以在做Ki-67染色的時(shí)候我們也會(huì)用FOXP3的固定/破膜方式來(lái)替代乙醇的方案，而且大多數(shù)時(shí)候是可以獲得不錯(cuò)的染色結(jié)果。

用BioLegend FOXP3 Buffer set對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定破膜處理后，染Ki-67抗體，左圖：小鼠淋巴結(jié)樣本；右圖：小鼠脾臟樣本。

• 對(duì)于需要先固定再染色的樣本，注意點(diǎn)在哪里？

流式實(shí)驗(yàn)中，有一些情況我們希望或需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)先固定處理，比如前文說(shuō)過(guò)的傳染病人的樣本或者是需要檢測(cè)蛋白翻譯后修飾的樣本。對(duì)于需要預(yù)固定的樣本，首先需要考慮預(yù)先固定處理對(duì)檢測(cè)指標(biāo)的影響，有很多指標(biāo)先染色再固定和先固定再染色出來(lái)結(jié)果差異非常大，導(dǎo)致這些差異原因和指標(biāo)的類型、抗體的克隆號(hào)等因素都有關(guān)系。

如果我們的流式實(shí)驗(yàn)要求對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)先固定的處理，那實(shí)際上這就需要提前去驗(yàn)證染色方案里所選的克隆是否適用于先固定后染色，這也有一定工作量。推薦大家參考借鑒BioLegend關(guān)于固定的專題，里面有做了很多克隆能否適用于先固定后染色的驗(yàn)證。

對(duì)比信息請(qǐng)參考：www.biolegend.com/fixation

• 樣本需要先固定再染色，但方案里的一些指標(biāo)不兼容預(yù)先固定，該怎么辦？

這個(gè)問(wèn)題其實(shí)相當(dāng)棘手，因?yàn)閾?jù)我們了解的情況，目前市面上還沒(méi)有一個(gè)試劑生產(chǎn)廠家有這樣“完美”固定試劑可以先固定樣本而不對(duì)后續(xù)染色產(chǎn)生任何影響，如果有的話，那我們今天所說(shuō)的關(guān)于固定的問(wèn)題，都不算是問(wèn)題。

在實(shí)際遇到預(yù)固定和指標(biāo)不兼容時(shí)，我們會(huì)做如下建議：（1）使用替代指標(biāo)來(lái)更換那些受固定影響的指標(biāo)；（2）如果沒(méi)有可以替代指標(biāo)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)重要性原則來(lái)取舍檢測(cè)指標(biāo)，比如是磷酸化的指標(biāo)會(huì)比表面的指標(biāo)更為重要。雖然這一段看起來(lái)有一點(diǎn)像“廢話”，但我們需要在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中學(xué)會(huì)做取舍和判斷。

• Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al.Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunologicalstudies. Eur J Immunol. 2017 Oct; 47(10):1584-1797.

• Li N, Hallde?n G, Hjemdahl P. A whole-blood flow cytometric assay for leukocyte CD11b expression using fluorescencesignal triggering. Eur J Haematol. 2000: 65:57±65.

• Judith C. Stewart, Michelle L. Villasmil andMark W. Frampton. Changes in Fluorescence Intensity of Selected LeukocyteSurface Markers Following Fixation. Cytometry A. 2007 Jun;71(6):379-85.