還在糾結“單拷貝克隆產量低,高拷貝克隆穩定性差”這個問題嗎?現在只需一支誘導劑就可人為控制質粒的拷貝數啦!
首先安利一下Epicentre的專利技術——CopyControl?克隆系統,能夠讓您共享單拷貝和高拷貝的優點。CopyControl?克?。菏紫纫詥慰截愋问缴L,單拷貝可以確保插入穩定及成功克隆編碼基因序列;在需要的時候,通過誘導液誘導成高拷貝克隆,以便下游應用所需。這一系統可以用來構建PCR克隆,對于BAC,Fosmid文庫等大型質粒格外有用。
CopyControl?克隆系統有兩個重要成分,相輔相成,缺一不可:
1.CopyControl? pCC1和pCC2載體
pCC1和pCC2載體含有兩個復制起始位點:單拷貝的大腸桿菌F-因子復制子和誘導型的高拷貝oriV。其中OriV的啟動,需要trfA基因產物,由CopyControl?的另一個重要成分——TransforMax? EPI300 E.coli菌株提供。
圖1 pCC1載體圖譜
2.TransforMax? EPI300 E.coli
這是一種工程菌株,含有受誘導啟動子控制的trfA基因,在誘導的條件下可以提供啟動oriV所需要的trfA基因產物。
圖2 TransforMax? EPI300 E.coli菌株基因型
CopyControl?克隆誘導步驟
1、將目標DNA片斷連接到已經線性化、去磷酸化的CopyControl? pCC1 Vector上。
2、轉化TransforMax? EPI300 E.coli感受態細胞,涂皿,在氯霉素LB培養基上篩選。(在這種條件下,trfA基因的表達被抑制,克隆以單拷貝數量生長。)
3、挑選單克隆,進行培養。
4、加CopyControl? Induction solution到管中,誘導TransforMax? EPI300宿主細胞內trfA基因的表達,從而啟動oriV,克隆由單拷貝轉化為高拷貝。
5、用常規方法從誘導細胞內分離DNA。
圖3 CopyControl?克隆流程
相關產品信息
美國Lucigen公司成立于1998年,提供各類用于分子生物學相關產品,可以使研究者成功克隆較難克隆的基因,其在2016年收購了Illumina旗下Epicentre產品線。目前產品類別主要包括:體外轉錄、基因克?。˙AC克隆試劑盒)、感受態細胞(TG1噬菌體文庫構建感受態)、體外擴增、轉座子突變、蛋白表達、文庫構建等。