引導語：

2021年6月23日，中國首款CAR T藥-阿基侖賽注射液獲得國家藥品監督管理局批準上市。這是一種自體免疫細胞注射劑，由攜帶CD19 CAR基因的逆轉錄病毒載體進行基因修飾的自體靶向人CD19嵌合抗原受體T細胞（CAR T）制備，用于治療既往接受二線或以上系統性治療后復發或難治性大B細胞淋巴瘤成人患者，這將開啟中國腫瘤細胞治療的新未來。

CAR T技術出現了多年并經歷了諸多改進才逐漸進入臨床，除了被用來治療急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，改進后也被用來治療實體瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心臟病等疾病。近年來，國內外已經有很多關于CAR T細胞的研究和報導。2021年4月2日，在期刊Clinical Cancer Research（影響因子IF=10.107）發表了一篇標題為“A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-Specific CAR T Cells in Solid Tumors”的論文，研究泛組蛋白脫乙酰基酶抑制劑對實體瘤中B7-H3.CAR T細胞的抗腫瘤活性的影響。

接下來小編就給大家介紹一下這篇高分文獻。

一、B7-H3在實體癌細胞上的表達及其與多種實體癌患者生存率的關系

B7-H3，也稱為CD276，它是一種免疫檢查點分子，屬于免疫檢查點抑制劑B7超家族。它的生物學特性功能目前尚不清楚，它的功能是共刺激或者共抑制分子取決于它所參與的免疫反應。在這篇文章，作者為了測試表觀遺傳療法是否可以增強 B7-H3.CAR T細胞對多種實體癌類型的抗腫瘤活性，通過in vitro和ex vitro實驗，評估了B7-H3.CAR T 細胞和脫乙酰酶抑制劑 (SAHA) 聯合治療幾種實體癌的療效和潛在機制。結果發現B7-H3 在大多數人實體瘤樣本中會表達，但在正常組織中表達受限，B7-H3.CAR T 細胞在體外選擇性殺死表達 B7-H3 的人癌細胞系。

作者采用中山紀念醫院和中山大學自2007年4月至2013年12月期間收集的186例三陰性乳腺癌（TNBC）樣本，298例頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）標本樣本，152個非小細胞肺癌（NSCLC）樣本和89例皮膚黑色素瘤（SKCM）樣本用于B7-H3染色和分析。另外，采用中山紀念醫院和中山大學自2016年5月至2018年11月期間收集的47例頭頸部鱗狀細胞癌樣本和39例三陰性乳腺癌樣本建立病人來源的異種移植模型。采用50ml健康獻血者的外周血，以及70ml頭頸部鱗狀細胞癌患者和三陰性乳腺癌患者的外周血建立這兩種癌癥細胞系，建議TNBC-S3和HNSCC-Y2細胞系，以產生CAR T細胞。

首先，作者評估了B7-H3在實體癌和正常組織中的表達。如圖1所示，B7-H3廣泛表達于多種實體癌，但在正常組織有限表達。低表達B7-H3的TNBC，HNSCC，以及SCLC癌癥患者的存活率更長。B7-H3表達升高與腫瘤患者的短存活率有關。因此，B7-H3不僅是實體癌的一個預后生物標志物，而且是腫瘤免疫治療的一個重要靶點。

圖1：B7-H3在實體癌細胞上的表達及其與多種實體癌患者生存率的關系。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

二、脫乙酰酶抑制劑 (SAHA)可顯著增加多種人實體癌細胞的B7-H3的表達

實體瘤中的抗原異質性是CAR T細胞的免疫治療的主要障礙之一。抗原豐富區域促進了CAR T細胞的招募以及CAR T細胞和靶細胞之間的相互作用。組蛋白脫乙酰基酶抑制劑已經被證明可以有效的上調轉錄激活。因此，作者檢測了組蛋白脫乙酰基酶抑制劑是否能增強B7-H3在實體癌細胞中的表達。如圖2。考慮到劑量限制毒性和其他臨床試驗中觀察到的與組蛋白脫乙酰基酶抑制劑相關的不良反應，作者篩選了一系列的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，結果發現SAHA可以最有效的上調B7-H3的表達，如0.5 mmol/L的SAHA可以誘導B7-H3表達水平上調兩倍，并且SAHA可以上調B7-H3轉錄和蛋白水平。同時檢測了B7-H3在經SAHA處理的多種正常人細胞上的表達，包括原代舌肌細胞，原代胃上皮細胞細胞，原代十二指腸細胞，原代肝細胞，原代胰腺細胞和原代卵巢細胞，發現SAHA沒有增加B7-H3在人類正常細胞表面的表達。

圖2：SAHA通過組蛋白修飾顯著增加了多種人實體癌B7-H3的表達。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

三、SAHA可顯著增強實體瘤細胞共培養的B7-H3. CAR T細胞的特異性細胞毒性

如圖3，相比于未預處理的癌細胞，SAHA預處理的CAR T細胞共培養的癌細胞，經過24小時的孵育后，細胞上清中四種細胞因子：GMCSF，IFNγ，IL2和TNFα顯著增加。說明SAHA可增強實體癌細胞對B7-H3.CAR T細胞的敏感性，并增強B7-H3.CAR T細胞在共培養體系中的細胞毒活性。

圖3：SAHA可增強實體癌細胞對B7-H3.CAR T細胞的敏感性，并增強B7-H3.CAR T細胞在共培養體系中的細胞毒活性。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

四、SAHA可抑制B7-H3.CAR T免疫抑制信號通路以及增強蛋白質轉運信號通路

作者進行mRNA分析以檢測B7-H3.CAR T細胞轉錄組在SAHA處理下的變化。如圖4，SAHA顯著改變了轉錄組，有6172個基因表達顯著上調，6225個基因表達顯著下調。然后，采用基因富集分析去鑒定CAR T改變的細胞表型，發現與蛋白質運輸相關的基因上調，而與免疫抑制和未折疊蛋白質反應相關的基因下調。

甲基胞嘧啶二氧酶（TET2）在最近的研究中證明可以有效調節CD19.CAR T細胞。因此，作者研究了TET2的潛在作用。如圖4 E–I，敲除B7-H3.CAR T細胞的TET2后，CAR T細胞釋放的四種細胞因子GM-CSF，IFN-γ，IL-2, TNF-α增多，細胞的毒性活性增加，釋放的穿孔素和顆粒酶B也增多。因此，SAHA可以通過上調蛋白轉運信號通路增加T細胞表面B7-H3.CAR的表達。此外，SAHA還會影響B7-H3.CAR T細胞中細胞毒性機制的關鍵成分TET2。

圖4：SAHA上調蛋白質轉運信號通路和減少免疫抑制分子的表達，例如CTLA-4和TET2，圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors

五、SAHA可增強異種移植模型中B7-H3.CAR T細胞的抗腫瘤活性

作者用體內實驗測試SAHA和B7-H3聯合治療，首先建立第0代（P0）小鼠原位細胞系。如圖5，在CAR T細胞注入后的第30天，聯合治療顯著控制了腫瘤的生長，聯合治療組的凋亡癌細胞百分比、B7-H3表達水平和腫瘤浸潤T細胞數也最高，在SAHA和B7-H3.CAR T細胞治療組中也發現了比其他組更具浸潤性的生成IFNγ的T細胞。

圖5：SAHA和B7-H3聯合的CAR-T細胞在TNBC和HNSCC異種移植小鼠模型中表現出良好的腫瘤控制作用。圖片來源：A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3-specific CAR-T Cells in Solid Tumors.

六、結論

綜上所述，作者從人源化mab 8H9中獲得B7-H3.CAR T細胞，篩選了組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，發現SAHA介導可以上調B7-H3在實體癌細胞中的表達以及B7-H3.CAR T細胞在人T細胞中的表達。SAHA和B7-H3.CAR T細胞的聯合后對多種類型的人實體癌的抗腫瘤活性增加。

重頭戲來了!

在這篇高分文獻中，作者在異體移植模型中分析腫瘤浸潤性的生產IFNγ的T細胞，采用的是酶聯免疫斑點法去定量生產IFNγ的T細胞。采用的試劑盒是達科為的達優系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit（cat#2110001和cat# 2110005），如下圖。

 

產品介紹

達科為公司的達優^?系列Human IFN-γ Precoated ELISPOT Kit采用原裝進口高親和力高效價抗體對，經預包被PVDF板、低溫干燥、真空密封包裝等工藝流程制備。成品PVDF板上預包被的抗體分布均勻、效價穩定，實驗檢測時間從3天縮短為2天，大幅度減少無菌操作的實驗步驟，減輕實驗者的勞動強度和減少污染的幾率，使得實驗者能夠輕松、高效地完成復雜的ELISPOT檢測實驗。

■ 應用范圍：本試劑盒專用于科研。

■ 保存條件：2-8℃可穩定保存12個月。

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參考文獻：

Lei, Xinyuan, et al. A Pan-Histone Deacetylase Inhibitor Enhances the Antitumor Activity of B7-H3–Specific CAR T Cells in Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 2021.

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