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這種陰選方法快速簡單,10分鐘得到想要的活性細胞!

作者:admin 信息來源:達科為 日期:20210728 打印 字體:  
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在細胞分選中,陰選通常是指對非目的細胞進行標記和去除,來得到目的細胞。避免通過直接的標記目的細胞(比如使用表面特異性抗體標記),從而來減少細胞活化可能。因此,陰選方法的優勢在于可以保持目的細胞未受刺激的原始狀態,分選速度快。不過相對陽選而言純度稍低,而且需要事先對原始樣品的細胞組分有所了解,準備相應的標記抗體。

陰選的優勢與劣勢

 

本文將分享一種新的陰選方法和相關數據,利用Strep-Tactin?TACS的瓊脂糖層析柱,這種層析柱既可用于細胞陽選,也能用于細胞陰選中。
 

 

為了評估Strep-Tactin?TACS瓊脂糖柱細胞陰選的效率,實驗從外周血單個核細胞(PBMC)樣品中富集了CD3- CD56+自然殺傷細胞(NK)。材料為Strep-Tactin?TACS瓊脂糖柱以及生物素化的抗體,僅10分鐘,便完成了細胞陰選 (圖1)。
 

流程如下


 

陰選流程:生物素化抗體與PBMC孵育標記非目的細胞,加入至親和層析柱后,即可收集目的細胞

實驗方案
CD3- CD56+ NK的細胞陰選
  • 將1 x 107 的PBMC細胞用100μl的Buffer稀釋(Buffer CI:含0.5% BSA的PBS緩沖液,1 mM EDTA)
  • 加入多種生物素化抗體,室溫下孵育5分鐘。生物素化的抗體包含以下幾種,每種抗體0.5 μg:CD235a (erythrocytes), CD14 (monocytes), CD3 (T cells), CD15 (granulocytes), CD19 (B cells), CD36 (thrombocytes), CD123 (hematopoietic stem cells) 和CD279 (PD-1)。
  • 將孵育好的樣品加入到1 ml的Strep-Tactin?TACS瓊脂糖層析柱上(柱子最大結合能力:1 x 108個細胞)。
  • 當樣品完全進入柱子后,加入10 ml Buffer洗脫兩次,就可以得到未結合的細胞了。后續使用流式細胞術檢測富集的NK細胞。 

(此處用到的試劑見文末)

 

結果與討論

通過使用陰選將非目的細胞去除后,獲得了高純度的目的細胞群。實驗用到了Strep-Tactin?TACS瓊脂糖層析柱,并進行了兩次獨立實驗。結果如圖2所示。

NK細胞從6%的起始豐度(圖2A)通過富集達到了86%(圖2B)。所有抗體標記的細胞群幾乎均去除,剩余的非NK細胞主要成分為未標記的細胞。數據表明, Strep-Tactin?TACS瓊脂糖柱不僅可以在陽選中使用,還可以搭配適當的抗體標記,有效進行細胞陰選。
 

圖2:通過陰選富集PBMC中的CD56 + NK細胞。Strep-Tactin?TACS瓊脂糖柱與生物素化抗體結合,從而實現NK細胞的富集,純度從6%(A)提高到86%(B)(n = 2)

 

實驗材料

為什么使用Strep-Tactin?TACS?

實驗中使用的Strep-Tactin?TACS親和層析柱,主要成分Strep-Tactin?是鏈霉親和素(Streptavidin)的一種突變體,借助鏈霉親和素-生物素作用原理,Strep-Tactin?與生物素(biotin)的親和力介于100 pM – 100 fM間。當向含有的Strep-Tactin?層析柱中加入生物素化的抗體時,便能將其固定在柱子中,特異性捕獲細胞,進行陰選。

 

抗體的選擇

實驗中可以選擇的抗體有親和力較高的生物素化單克隆抗體(圖3A),或帶有Twin-Strep-tag?的抗體,如圖3B所示。

帶Twin-Strep-tag?的單克隆抗體在生產和純化更便捷,還可以通過加入生物素來洗脫已經結合在柱子上的細胞。并且,Twin-Strep-tag?的單克隆抗體的位置相對更固定一些。

使用生物素化抗體好處在于其與Strep-Tactin?的親和力相比之下更高,可以稍提高陰選效率,但是總體來說兩種類型的抗體對細胞陰選都是非常有效的。
 

圖:單克隆抗體用生物素(A)或Twin-Strep-tag?(B)標記,兩種都可以固定在Strep-Tactin?TACS瓊脂糖層析柱中。


總而言之,作為靈活的細胞研究工具,Strep-Tactin?TACS瓊脂糖層析柱在細胞分選的應用不僅限于陽選,還可以在陰選中結合多種生物素化抗體(或Twin-Strep-tag?標記的抗體)一起使用。整個細胞分選過程只需10分鐘,是一種快速有效的細胞陰選方案。

 

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