OptiPrep?是Serumwerk Bernburg AG的一款多功能分離液,Serumwerk Bernburg成立于1954年,是一家現代化的、專門的生產商和服務商。OptiPrep生產、包裝、發布嚴格按照GMP和ISO13485標準執行。
OptiPrep
OptiPrep?是Serumwerk Bernburg AG的一款多功能分離液,其主要成分是60%碘克沙醇。密度為1.32 g/ml,可以用來分離多種種屬、以及多種細胞、病毒、蛋白質、核酸等不同顆粒。OptiPrep不含多糖,對靶細胞無毒副作用,且內毒素含量<0.13EU/ml,遠低于歐洲標準(1EU/ml)。
配制不同密度的OptiPrep:
使用密度溶液的配制方法,是基于使用0.85% (w/v) NaCl, 10 mM Tricine-NaOH, pH 7.4作為細胞懸浮培養基。為了使溶液在任何梯度下都保持濃度恒定,首先將4體積的OptiPrep?與2體積的溶液A (3倍濃度的緩沖液) 混合,來制備40% (w/v)的碘克沙醇工作溶液(WS)。然后,使用溶液B進一步稀釋碘克沙醇工作溶液,以獲得適當密度的梯度溶液,常見的密度配制見表1。
注:HEPES/Tricine可以被其它有機緩沖液替代。如果溶液B中需要添加低濃度(1-2mM)的其它物質,如Mg2+或Ca2+,可以在溶液A也添加3-6 mM,以保持其在梯度中不變,如果不需要維持溶液恒定或二價陽離子濃度恒定,OptiPrep?可以直接用溶液B稀釋(含有或不含低濃度的二價陽離子),所獲得的梯度溶液的密度和折射率與表1相比可能會有微小的差異,所有梯度溶液的滲透壓都在285-305 mOsm范圍內。
PS:使用等滲鹽溶液和培養基配制、使用含血清的培養基配制方法請參考往期文章:
OptiPrep?的應用——不同密度梯度溶液的配制(關注下方“拉斯維加斯.0567CC”公眾號)
OptiPrep滲透壓(約為290 mOsm/kgH2O)與血漿滲透壓(約為300mOsm/kgH2O)相近,較少考慮平衡滲透壓,在使用相同稀釋溶液的情況下,分離液密度與碘克沙醇的百分比成正比。
Percoll
Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮——polyvinylpyrrolidone (PVP)的硅膠顆粒的水溶液。滲透壓很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,密度為1.3g/ml左右。所以配置前要調整滲透壓。
配制不同密度的Percoll:
Percoll具有非常低的滲透壓(< 25mOsm /kg H2O),配制不同Percoll時需要注意調整滲透壓。將9份Percoll (v/v)加入1份1.5 M NaCl (v/v)或10倍濃度的細胞培養基中,制備等滲Percoll儲存液(SIP,Percoll Stock Isotonic Percoll)。對于對離子敏感的亞細胞粒子,可以通過將9份Percoll (v/v)加入1份2.5 M蔗糖(v/v)來制備蓄積等滲Percoll (SIP)。
不同等滲溶劑配置的 Percoll 儲存液具有不同密度
稀釋儲存液SIP以降低密度只需添加0.15 M NaCl(分離亞細胞顆粒或病毒時加入0.25 M蔗糖溶液),可將等滲Percoll(SIP)的溶液稀釋至較低的密度進行分離細胞。以下公式可用于計算獲得所需密度的溶液所需各組分的體積。
其中Vy =稀釋用等滲溶劑的體積(mL)
Vi = SIP的體積(mL)
ρi = SIP的密度(g / mL)
ρy =稀釋用等滲溶劑的密度(g / mL)
(0.15 M NaCl的濃度為1.0046 g / mL,0.25 M蔗糖的密度為1.032 g / mL)
ρ=最終溶液的密度(g / mL)
例如
要將55 mL的SIP稀釋至1.07 g / mL的最終密度,計算所需的0.15 M NaCl量。
所需0.15 M NaCl的體積= 55×(1.123-1.07)/(1.07-1.0046)= 44.6ml
用等滲鹽水或蔗糖溶液稀釋Percoll儲存液 (SIP)。ρ0是Percoll原液的密度
注意:百分比是Percoll儲存液的體積占比
以0.15M NaCl作為等滲溶液稀釋Percoll密度與百分比的對應表。(來源于網絡僅供參考)
上面的公式可用于獲得非常接近所需實際密度的密度。但是,輕微的稀釋介質的體積 和密度的變化會影響最終密度。
OptiPrep VS Percoll配比參照表